近日，中国药科大学董廖斌课题组联合南京大学张博副教授和美国佛罗里达大学Jeffrey Rudolf助理教授，获得并解析了首个细菌来源II型倍半萜环化酶的晶体结构，破解了存在于II型萜类环化酶家族中数十年的催化机制难题——镁离子结合簇，进而完整解析出该家族环化酶的详细催化机制，相关研究成果以“Discovery, Structure, and Mechanism of a Class II Sesquiterpene Cyclase”为题发表在Journal of the American Chemical Society（https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.2c09412）上。
萜类天然产物是自然界中数量最多，结构最多样化的天然产物家族。萜类天然产物来源于不同长度的线性焦磷酸前体，而萜类环化酶负责催化该线性前体生成多环结构。根据不同的催化机制，序列及晶体结构，萜类环化酶可被分为两类，即I型和II型萜类环化酶。I型萜类环化酶通过脱去焦磷酸基团形成碳正离子进而环化，该过程依赖镁离子的参与。目前，已有报道超过30种 I型萜类环化酶的晶体结构，其中的镁离子结合簇也得到了深入的研究，其主要位于焦磷酸基团周边且与萜类环化酶的DDxxD及NSE/DTE催化基序有极性相关。但II型萜类环化酶的结构目前仅报道7例，其中5例的底物均具有焦磷酸基团；根据相关的生物化学体外酶学实验，II型萜类环化酶通过质子化底物的末端双键或者环氧基团形成碳正离子，不需脱去焦磷酸基团，但加入金属镁离子后，其催化效率呈现数千倍的增长，故有假设认为II型萜类环化酶中也存在一个镁离子结合簇，以辅助底物结合于酶的活性空腔。但在此前报道的5个II型萜类环化酶结构中均未发现这一镁离子结合簇。此外，在已有的7个II型萜类环化酶中，2个为三萜环化酶，4个为二萜环化酶，1个为杂萜环化酶，唯独倍半萜环化酶的结构尚未报道。针对以上科学问题，董廖斌课题组开展了找寻II型倍半萜环化酶的研究工作。
首先，作者对角鲨烯-霍烷环化酶的PFAM数据库进行筛查。根据已有的文献报道，剔除已知的二萜环化酶及三萜环化酶及其相似基因的序列，得到45个潜在的II型倍半萜萜类环化酶基因。随后，针对该45个环化酶的基因序列分析显示，其中的12个基因具有 DxDD的保守催化基序；进一步结合基因组信息，发现其中的两个酶A0A2P2GK84 (Streptomyces showdoensis)及F8JSS1 (Streptomyces cattleya)的上游紧邻着一个Nudix水解酶，这一类型的水解酶曾报道于部分萜类的生物合成途径中，发挥着单磷酸水解酶的作用。该基因组信息提示A0A2P2GK84及F8JSS1可能是潜在的单功能II型倍半萜环化酶。随后通过体内异源表达实验，作者成功获得该酶的催化产物并将其鉴定为倍半萜drimenol，进一步体外生化表征实验揭示其为II型萜类环化酶，并分别命名为SsDMS和ScDMS。
为了对该特殊的II型倍半萜环化酶进行深入的研究，作者通过筛选和优化结晶条件获得了SsDMS的高质量apo-SsDMS（1.58 Å）及其复合物晶体结构。通过比较apo-SsDMS与经典的植物及细菌ent-copalyl diphosphate（ent-CPP）合酶发现，SsDMS是一个经典的以β结构域主导的βγ双结构域环化酶，其催化酸基团D303及R403的位置相较于二萜和三萜环化酶更为偏上，拥有着更小的活性口袋，暗示SsDMS为天然的II型倍半萜环化酶。此外，针对催化酸基团的突变结果显示该区域为催化过程中的关键位点。
通过比对SsDMS的复合物与apo-SsDMS结构，作者发现活性口袋中的多个氨基酸残基在底物进入口袋后发生了位移，且在活性口袋中的焦磷酸基团附近发现了一个含有两个镁离子的金属离子簇W165在apo状态下，其侧链位于底物的焦磷酸部分，而底物进入后，W165连带相邻的L166向外扩张使得香叶基焦磷酸（FPP）得以进入活性空腔，且原先位于活性口袋外的R132在底物进入后调转侧链使其与焦磷酸基团作用，而与镁离子互作的外周谷氨酸E169的侧链在底物进入后发生一定的翻转，使其与镁离子结合，从而起到锚定焦磷酸基团的作用。结合周边与焦磷酸互作的氨基酸信息，作者针对这些氨基酸进行了定点突变，进一步验证了这些氨基酸对于催化的重要性。更为重要的是，将E169突变为A或D后，SsDMS均失去了原有的活性，这表明与金属离子互作的氨基酸侧链长度起着关键作用。
基于以上研究结果，作者推测出该II型倍半萜合酶的完整催化机制，即在起始阶段，底物FPP形成一个预折叠的状态。底物FPP进入口袋时，W165与L166离开活性空腔；FPP进入后，R132翻转与焦磷酸基团互作；D303质子化末端双键产生碳正离子启动环化过程；此时，口袋周边的多个芳香性残基稳定产生的碳正离子中间体。借助于距离C4位最近的水分子Wat47，联合W393, Q497及Y505, Q497等残基，共同完成最终的脱质子步骤，形成最终的环化产物。最后，Y307对D303重质子化从而开始下一轮环化。
中国药科大学董廖斌课题组联合南京大学张博副教授和美国佛罗里达大学Jeffrey Rudolf助理教授，通过基因组挖掘，发现隐藏于细菌基因组中的II型倍半萜合酶，获得了该环化酶的晶体结构；在该酶的活性空腔中发现了一个特殊的含双镁离子的金属离子簇及与其结合的谷氨酸残基。该工作不仅确证了II型萜类环化酶真实存在着一个镁离子结合簇，解决了II型萜类环化酶中的镁离子结合簇难题，而且完整描绘出II型萜类环化酶的催化机制。此外，镁离子结合簇的发现显示出自然界选择进化出的萜类环化酶的精巧催化之美，并体现出I型与II型萜类环化酶在进化过程中针对催化中心的灵活保留以完成不同的催化使命。
团队简介
董廖斌博士，教授、课题组长（PI）、博士生导师。入选“国家海外高层次人才引进计划”青年项目、“江苏特聘教授”以及江苏省“双创计划”。2014年博士毕业于中国科学院昆明植物研究所，2014-2019年在美国斯克利普斯研究所从事博士后研究，并于2019年10月引进到中国药科大学工作。迄今，以通讯及第一作者等在J. Am. Chem. Soc. (5篇), Nature Commun., Science, Nat. Chem. Biol.等期刊发表47篇论文，申请专利2项，主持国家自然科学基金面上项目等省部级项目4项。课题组主要从事萜类天然产物的发现、生物合成和合成生物学研究；欢迎有志于从事天然产物生物合成和“化学-酶”法合成的有机化学背景的青年才俊加入课题组。联系方式：ldong@cpu.edu.cn.
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